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Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 22588 (2022) Citar este artículo

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Existe una gran demanda de desarrollo y demostración de nuevas tecnologías de desinfección para la protección contra diversos virus y bacterias patógenos. En este contexto, la irradiación ultravioleta (UV) ofrece un método efectivo y conveniente para la inactivación de microorganismos patógenos. La evaluación cuantitativa de la eficacia de la esterilización UV se basa en la simple ley de reciprocidad de dosis en el tiempo propuesta por Bunsen-Roscoe. Sin embargo, las constantes de velocidad de inactivación reportadas en la literatura varían ampliamente, incluso a la misma dosis y longitud de onda de irradiación. Por lo tanto, es probable que el mecanismo físico de la inactivación UV no pueda describirse mediante la simple ley de reciprocidad dosis-tiempo sino que requiera un proceso de inactivación secundario, que debe identificarse para aclarar la base científica. En este artículo, llevamos a cabo un experimento de inactivación de UV con Escherichia coli a la misma dosis pero con diferentes irradiancias y duraciones de irradiación, variando la irradiancia en dos o tres órdenes de magnitud. Mostramos que la eficacia de la inactivación obtenida por la irradiación con diodos emisores de luz ultravioleta difiere significativamente en un orden de magnitud a la misma dosis pero con diferentes irradiaciones a una longitud de onda fija. Para explicar esto, construimos un modelo estocástico introduciendo una segunda tasa de inactivación, como la debida a las especies reactivas de oxígeno (ROS) que contribuyen al daño del ADN y/o de las proteínas, junto con la tasa de inactivación UV basada en la fluencia. Al resolver las ecuaciones diferenciales basadas en este modelo, se dilucida claramente la eficacia de la inactivación en función de la irradiancia y la duración de la irradiación bajo las mismas condiciones de dosis de UV. El modelo propuesto muestra claramente que al menos dos tasas de inactivación están involucradas en la inactivación UV, donde la tasa de inactivación UV generalmente utilizada no depende de la irradiancia, pero la tasa de inactivación debida a ROS sí depende de la irradiancia. Llegamos a la conclusión de que los resultados de inactivación UV obtenidos hasta la fecha simplemente se ajustaron mediante una tasa de inactivación que superpuso estas dos tasas de inactivación. La eficacia de la radiación UV a largo plazo a baja irradiancia pero a la misma dosis proporciona información útil para futuras tecnologías de desinfección como la desinfección de grandes espacios, por ejemplo, habitaciones de hospital con luz UV, ya que puede reducir la dosis de radiación y su riesgo. al cuerpo humano.

Existe una gran demanda de desarrollo y demostración de tecnologías de desinfección eficientes para proteger contra diversos virus y bacterias patógenos. En esta situación, la esterilización por radiación ultravioleta (UV) está atrayendo especial interés porque la radiación UV ofrece un método efectivo y conveniente para la inactivación de microorganismos patógenos, incluidos los coronavirus1,2,3,4,5.

El principio de esterilización se basa en la ley de reciprocidad dosis-tiempo propuesta por Bunsen-Roscoe6, Log(N/N0) = − Γ × D, donde Γ (cm2/mJ) es la tasa de inactivación constante en función de la longitud de onda, D = τ × P, D (mJ/cm2) es la dosis de UV, P (mW/cm2) es la irradiancia de UV y τ (s) es la duración de la irradiación (de aquí en adelante, usamos D como dosis de UV, P como irradiancia de UV y τ como duración de la irradiación). Esta ley de reciprocidad se ha aplicado a muchas categorías diferentes de procesos de fotorreacción, como la fotopolimerización, la fotoconductancia y la fotodegradación, así como la esterilización UV7. La ley de reciprocidad supone que la velocidad del proceso de reacción fotoquímica es proporcional a la irradiación de la luz (proceso estocástico lineal), de modo que la cantidad del proceso depende solo de D. Si bien esto es cierto para la mayoría de los procesos de reacción fotoquímica primarios con irradiaciones de luz que no inducen efectos no lineales, hay muchas reacciones que no obedecen la ley de reciprocidad en un rango significativo de condiciones de reacción, como las polimerizaciones por radicales8. Además, las constantes de tasa de inactivación de muchas bacterias y virus por irradiación UV reportadas en la literatura varían ampliamente, incluso para estudios en los que se usaron la misma longitud de onda de irradiación y los mismos tipos y cepas de bacterias y virus9,10,11. Esta amplia gama de valores notificados parece sugerir que el mecanismo físico de la inactivación UV no puede describirse mediante la simple ley de reciprocidad dosis-tiempo; en su lugar, se debe identificar un proceso de inactivación secundario para aclarar la base científica7.

En este artículo, proponemos un modelo estocástico para explicar las diversas constantes de velocidad de inactivación para la misma D. Para validar el modelo estocástico propuesto aquí, realizamos un experimento de inactivación UV en la misma D pero con diferentes Ps y τs a una longitud de onda fija, variando la P en dos o tres órdenes de magnitud. Aquí, usamos Escherichia coli (E. coli) como muestra de inactivación porque esta bacteria es una de las muestras estándar utilizadas hasta la fecha en experimentos de inactivación UV12,13,14,15,16,17,18,19. Los resultados obtenidos aquí muestran que a 265 nm, la eficacia de la inactivación es mayor para τs más largos con una P más baja a la misma D. Sin embargo, esta tendencia fue menos pronunciada a 280 nm, y no observamos una diferencia tan significativa en el longitud de onda de irradiación de 308 nm.

Para explicar la eficacia de la inactivación en función de P y τ bajo las mismas condiciones D, obtuvimos dos conjuntos de ecuaciones diferenciales estocásticas en las que una tasa de inactivación [como la debida a las especies reactivas de oxígeno (ROS)] que contribuye al ADN y /o el daño a las proteínas se introdujo junto con la tasa de inactivación UV convencional. Resolviendo numéricamente las ecuaciones diferenciales basadas en este modelo, se puede explicar claramente la eficacia de la inactivación en función de la P y τ para la misma D. El modelo propuesto muestra claramente que al menos dos tasas de inactivación están involucradas en la inactivación UV, donde la tasa de inactivación UV generalmente utilizada no depende de la P, pero la otra tasa sí. Nuestra conclusión sugiere que los resultados de inactivación UV obtenidos hasta la fecha simplemente se ajustaron a una tasa de inactivación que superpuso estas dos tasas de inactivación.

Se incubó un cultivo puro de la cepa O1 de E. coli en caldo nutritivo (E-MC63; EIKEN Chemical Co., Japón) a 37 °C durante 20 h. Se obtuvo una concentración de 109 a 1011 unidades formadoras de colonias (UFC)/mL y se usó para los experimentos. Se tomó el cultivo puro de E. coli en fase estacionaria y se diluyó con solución salina normal (9 g de NaCl disueltos en 1 L de agua purificada) a 103 a 105 unidades formadoras de colonias (UFC)/mL. Para realizar los experimentos de inactivación utilizando UV-LED, se tomaron 600 μL de la solución dispersada y se inyectaron en un microtubo. Después de los experimentos de inactivación, se tomaron 100 μL de células bacterianas y se dispersaron en placas de agar. Las colonias se contaron después de la incubación durante 24 h a 37 °C. El número de CFU/mL en la suspensión de control (sin irradiación UV en el baño ultrasónico) se ajustó de modo que el número de CFU en una placa después de la irradiación UV esté en el rango de 102. Para el recuento de CFU en el rango de 101 a 104 , tomamos una imagen digital de la placa y utilizamos el software Processing (https://processing.org/) para el cálculo de las UFC.

La Figura 1a muestra la configuración de irradiación para el sistema de inactivación. Los experimentos de exposición UV se realizaron con LED UV de 265, 280 o 308 nm (265 nm: 265-FL-01-G01, 280 nm: 280-FL-01-G01 y 308 nm: 308-FL-01-G01 , DOWA ELECTRONICS MATERIALS CO., LTD., Japón). Los espectros UV de las longitudes de onda UV-LED utilizadas en esta condición (265 nm, 280 nm y 308 nm) se midieron utilizando un espectrómetro a través de una fibra óptica (BIM-6002A, Brolight Technology Corporation, Hangzhou, China). Como se muestra en la Fig. 1b, los LED UV de 265 nm, 280 nm y 308 nm exhibieron una emisión de longitud de onda máxima a 266,5 nm, 280,6 nm y 308,8 nm, respectivamente, con un ancho completo a la mitad de los anchos de banda máximos de 11,1 nm, 11,5 nm y 12,0nm. Para los experimentos de inactivación UV, la irradiancia UV se varió mediante la combinación de filtros UV-NIR de densidad neutra (ND) (# 88-369, Edmund Optics Japan Ltd., Tokio, Japón) cuya densidad óptica (OD) se varió de 0,3 a 3,5. Notamos aquí que no cambiamos significativamente el voltaje aplicado a los LED UV para obtener el mismo Ps, sino que los usamos alrededor de sus voltajes nominales para evitar cambios de pico espectrales causados por el cambio del voltaje aplicado. Además, la transmisión de los filtros UV-NIR ND cambia significativamente entre 200 y 300 nm. Por lo tanto, para los experimentos de exposición UV, se usaron diferentes magnitudes de P como se muestra en la Tabla 1.

Configuración óptica del sistema de inactivación UV y espectro de emisión de LED UV. ( a ) Configuración óptica del sistema de inactivación UV-LED. ( b ) Espectros de emisión de LED UV de 265 nm, 280 nm y 308 nm. Estos LED exhibieron emisiones de longitud de onda máxima a 266,5 nm, 280,6 nm y 308,8 nm, respectivamente, con ancho completo a la mitad de los anchos de banda máximos de 11,1 nm, 11,5 nm y 12,0 nm. (c) Fotografía de una muestra bacteriana de E. coli irradiada por UV-LED en un baño ultrasónico. También se colocó una muestra bacteriana de E. coli sin irradiación UV en el baño ultrasónico como muestra de control para tener en cuenta la inactivación provocada por las vibraciones ultrasónicas.

Luego, después de la transmisión a través de filtros ND, la radiación UV fue colimada utilizando una lente convexa con una distancia focal de 80 mm y fue guiada a un microtubo de polipropileno (2-8007-02, AS ONE Corporation, Osaka, Japón) que contenía una suspensión de E. coli (600 μL). El diámetro del haz obtenido fue de aproximadamente 20 mm de diámetro y el diámetro del microtubo fue de 9 mm; por lo tanto, toda la región de la suspensión se irradió con radiación UV. La P de radiación UV a la que se sometieron las bacterias se midió cada vez colocando un fotodiodo de Si extendido con UV con una apertura de 9,5 mm (S120VC, Thorlabs Inc., New Jersey, EE. UU.) en la superficie del microtubo. Sobre la base de este valor medido, se determinó el τ. Las combinaciones de P y τ en cada longitud de onda de irradiación se enumeran en la Tabla 1.

La suspensión en el tubo se difundió homogéneamente utilizando un baño ultrasónico (MCS-2, AS ONE Corporation, Osaka, Japón) con una frecuencia de 40 kHz y una potencia de salida de 55 W. La temperatura del baño ultrasónico se mantuvo a 23 °C mediante el uso de un intercambiador de calor, que inhibió el aumento de temperatura causado por 60 min de operación ultrasónica. La temperatura del microtubo habría aumentado hasta aproximadamente 50 °C durante los 60 min de operación ultrasónica (no debido a la radiación ultravioleta) sin el intercambiador de calor. La suspensión de control, que no se sometió a la radiación ultravioleta, también se colocó en el baño de ultrasonidos en cada medición para distinguir y excluir con precisión la inactivación causada por la ultrasonicación de la causada por la radiación ultravioleta, como se muestra en la Fig. 1c. Notamos aquí que la reducción de CFU causada por 60 min de ultrasonicación fue menos del 10% de la CFU de la muestra de control inicial20,21,22.

La inactivación logarítmica se calculó como Log (N/N0) con base 10, donde N es el número de UFC después de la irradiación UV en el baño ultrasónico y N0 es el número de UFC sin irradiación UV en el baño ultrasónico. Este procedimiento se realizó en todos los experimentos. Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces de forma independiente. Todos los datos se expresaron como media ± desviación estándar. Los análisis estadísticos de los datos se realizaron usando una prueba t de Student pareada. Los valores de p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

La relación de inactivación [Log(N/N0)] en el mismo D pero diferente Ps y τs se representan en función de τ (de 0 a 1000 s) mediante círculos rojos (10 mJ/cm2) y círculos azules (5 mJ/cm2). cm2) como se muestra en la Fig. 2a, b, c (a: 265 nm, b: 280 nm, c: 308 nm). Aquí, los valores elegidos de P y τ se enumeran en la Tabla 1 [(a) 265 nm; 5 mJ/cm2, (b) 265 nm; 10 mJ/cm2, (c) 280 nm; 5 mJ/cm2, (d) 280 nm; 10 mJ/cm2, (e) 308 nm; 5 mJ/cm2, y (f) 308 nm; 10 mJ/cm2].

Gráficos experimentales de la relación de inactivación [Log(N/N0)] para varias duraciones de irradiación (y varias irradiancias) a dosis de 10 mJ/cm2 (círculos rojos) y 5 mJ/cm2 (círculos azules) y longitudes de onda de irradiación de (a) 265 nm, (b) 280 nm y (c) 308 nm. La línea roja o azul representa la relación de inactivación ajustada teóricamente en función de la duración de la irradiación a una dosis constante (roja: 10 mJ/cm2, azul: 5 mJ/cm2) pero en diferentes condiciones de irradiación. (d) Determinación de Γ1 por la pendiente inicial de la curva para resultados de 265 nm y 10 mJ/cm2, donde la curva verde está descrita por Γ1 = 2 × 10−4 cm3/s, la curva roja está descrita por Γ1 = 2 × 10−3 cm3/s, y la curva azul está descrita por Γ1 = 2 × 10−2 cm3/s. (e) Determinación de Γ2 por la pendiente de la cola de la curva para resultados de 265 nm y 10 mJ/cm2, donde la curva verde está descrita por Γ2 = 0,07 cm2/mJ, la curva roja está descrita por Γ2 = 0,7 cm2/mJ, y la curva azul está descrita por Γ2 = 7,0 cm2/mJ. (f) Determinación de Γ4 por la altura de la cola de la curva para resultados de 265 nm y 10 mJ/cm2, donde la curva verde está descrita por Γ4 = 2,8 cm3/s, la curva roja está descrita por Γ4 = 28 cm3/s ( los círculos rojos son resultados experimentales), y la curva azul está descrita por Γ4 = 280 cm3/s.

Para una irradiación de 265 nm y D = 10 mJ/cm2 [círculos rojos en la Fig. 2a], la reducción de P en dos o tres órdenes de magnitud (aquí comparamos las relaciones obtenidas para τ≒0 s y τ≒1000 s. ) provoca la reducción significativa de la relación en aproximadamente un orden de magnitud, lo que sugiere que la eficacia de la inactivación fue aproximadamente 10 veces mayor (valor de p < 0,05) para τs más largos y una P más baja. Al reducir la D de 10 mJ/ cm2 a 5 mJ/cm2, como se muestra en los círculos azules de la Fig. 2a, se obtuvieron resultados similares. Sin embargo, la diferencia en las proporciones en diferentes Ps fue menos pronunciada y la eficacia de la inactivación se redujo a aproximadamente 7 veces (valor p < 0,05).

En el mismo D, se obtuvieron resultados similares con irradiación de 280 nm como se muestra en la Fig. 2 (b) (círculos rojos: 10 mJ/cm2 y círculos azules: 5 mJ/cm2). La diferencia en las proporciones en diferentes Ps fue menos pronunciada. Por ejemplo, la eficacia de D = 10 mJ/cm2 fue aproximadamente 7 veces mayor (valor de p < 0,05) y la de D = 5 mJ/cm2 fue aproximadamente 5 veces mayor (valor de p < 0,05) para τ más largos (τ ≒1000 s) y menor P en comparación con τ más corto (τ ≒0 s) y mayor P.

Sin embargo, a la longitud de onda de irradiación de 308 nm, no pudimos observar una reducción significativa de las proporciones al cambiar la P en las mismas condiciones de D, como se muestra en la Fig. 2c. Por ejemplo, la eficacia de D = 10 mJ/cm2 (círculos rojos) fue aproximadamente 1,3 veces mayor (valor p = 0,19) y la de D = 5 mJ/cm2 (círculos azules) fue aproximadamente 1,2 veces mayor (valor p = 0,23) para τ más largos (τ ≒1000 s) y P más bajos en comparación con τ más cortos (τ≒0 s) y P más altos. Sin embargo, los valores de p muestran que no hay diferencia estadística en la relación entre τs más largos y más cortos .

Se varió la CFU inicial entre 102 y 104 para examinar si las proporciones de reducción dependían del número de CFU iniciales. Sin embargo, como fue observado de manera similar por Hamamoto et al.23, no pudimos observar cambios significativos en las tasas de reducción.

Las teorías de objetivos con modelos de un solo impacto o de múltiples impactos se utilizan generalmente para el análisis de la inactivación UV24,25,26, y la ley de Bunsen-Roscoe6 es el principio básico para el análisis de la inactivación UV. Sin embargo, estas teorías no pueden explicar la gran diferencia en la eficacia de la inactivación en el mismo D pero diferente Ps en una longitud de onda fija. Por otro lado, es generalmente conocido que la radiación UV genera especies reactivas de oxígeno (ROS) y que las ROS dañan el ADN, las membranas y las células27,28. Resultados recientes sugieren que las ROS juegan un papel importante en la inactivación de UV y que para una D dada, la inactivación de UV es más efectiva para una P más baja y un τs más largo27,28.

Aquí, asumimos que tanto la radiación ROS como la UV causan daño en el ADN. La Figura 3 muestra el modelo cuantitativo que describe los procesos y sus tasas de daño en el ADN: (i) Γ0 (cm2/mJ): la tasa a la que la radiación UV causa directamente daño en el ADN mediante la formación de dímeros de timina29,30,31,32, 33; (ii) Γ1 (cm3/s): la velocidad a la que los radicales ROS causan daño al ADN; (iii) Γ2 (cm2/mJ): la tasa de generación de radicales ROS en las bacterias por radiación UV; (iv) Γ3 (1/s): el tiempo de vida de los radicales ROS 34,35,36,37; y (v) Γ4 (cm3/s): la tasa de destrucción mutua de los radicales ROS. En este caso, la tasa de reducción del número de bacterias N(t) (1/cm3) y la tasa de generación de radicales ROS R(t) (1/cm3) en función del tiempo (0≤t≤τ) se pueden expresar por las siguientes ecuaciones diferenciales estocásticas:

donde P es la irradiancia (mW/cm2). Al resolver estas dos ecuaciones diferenciales, tanto N(t) como R(t) pueden ser descritas por la variable t con P como parámetro. Al considerar la condición D constante, como τ × P = D (mJ/cm2) = constante para la solución de las ecuaciones anteriores. (1) y (2), podemos describir la eficacia de la inactivación en el mismo D pero diferente Ps.

Modelo cuantitativo que describe los procesos de daño del ADN. La radiación ultravioleta daña directamente el ADN mediante la formación de dímeros de timina o la generación de radicales ROS (círculos rojos) en las bacterias por la radiación ultravioleta, que daña el ADN. Las tasas de daño en el ADN se describen a continuación: Γ0 (cm2/mJ): la radiación UV causa directamente daño en el ADN mediante la formación de dímeros de timina, Γ1 (cm3/s): los radicales ROS dañan el ADN, Γ2 (cm2/mJ): ROS los radicales son generados en las bacterias por la radiación UV, Γ3 (s−1): tiempo de vida de los radicales ROS, y Γ4 (cm3/s): destrucción mutua de los radicales ROS.

Aquí, describimos cuantitativamente el procedimiento para la determinación de cada tasa en función del resultado de la irradiación de 10 mJ/cm2-D y 265 nm que se muestra en la Fig. 2a como ejemplo representativo. Integramos la Ec. (1) de la siguiente manera:

Al considerar la Ec. (3), en el límite de τ→0 con τ × P = D (mJ/cm2) donde D es constante, Γ0 (cm2/mJ) puede determinarse por el valor del intercepto Log (N/N0). Obtuvimos Γ0 = 0,22 (cm2/mJ). Aquí, notamos que esta curva teórica no comienza desde (0, 0) sino desde (0, − Γ0D/2.3) porque P se describe como P = D/τ [ver Eq. (3)]. Por lo tanto, la disminución de D conduce a un mayor valor de la intersección. Esta tendencia concuerda con los valores observados experimentalmente del intercepto, como se muestra en la Fig. 2a.

Otros parámetros, como Γ1, Γ2 y Γ4, pueden determinarse mediante las características de la curva, como se muestra en la Fig. 2d–f. Por ejemplo, el valor de Γ1 se refleja en la pendiente inicial de la curva, como se muestra en la Fig. 2d, donde la curva verde está descrita por Γ1 = 2 × 10−4 (cm3/s), la curva roja está descrita por Γ1 = 2 × 10−3 (cm3/s) (los círculos rojos son resultados experimentales), y la curva azul está descrita por Γ1 = 2 × 10−2 (cm3/s); por lo tanto, elegimos Γ1 = 2 × 10−3 (cm3/s). A continuación, el valor de Γ2 está determinado por la pendiente de cola de la curva, como se muestra en la Fig. 2e, donde la curva verde está descrita por Γ2 = 0,07 (cm2/mJ), la curva roja está descrita por Γ2 = 0,7 (cm2 /mJ) (los círculos rojos son resultados experimentales) y la curva azul está descrita por Γ2 = 7,0 (cm2/mJ); y elegimos Γ2 = 0,7 (cm2/mJ). El parámetro Γ4 se determina ajustando la altura de la cola de la curva, como se muestra en la Fig. 2f, donde la curva verde está descrita por Γ4 = 2,8 (cm3/s), la curva roja está descrita por Γ4 = 28 (cm3/s ) (los círculos rojos son resultados experimentales), y la curva azul está descrita por Γ4 = 280 (cm3/s); y elegimos Γ4 = 28 (cm3/s).

La vida útil de ROS está correlacionada con Γ3 y Γ4, que no depende de la longitud de onda de la irradiación. Después de la determinación de Γ4, se determina que el parámetro Γ3 es Γ3 = 1 (1/s). Es probable que el tiempo de vida determinado para Γ3 sea un valor razonable porque concuerda bien con los valores informados previamente34,35. En particular, al utilizar estos parámetros de Γ0 a Γ4, que se determinan en función de los resultados de 265 nm y 10 mJ/cm2, podemos dibujar curvas teóricas de 265 nm para varias condiciones de dosis. La curva azul que se muestra en la Fig. 2a se dibujó para una condición de 265 nm y D = 5 mJ/cm2 usando el mismo Γ0 a Γ4.

Las Figuras 2a, b, c muestran los gráficos experimentales (círculos sólidos) y las curvas ajustadas teóricamente (curvas sólidas) obtenidas mediante el procedimiento de ajuste anterior para longitudes de onda de irradiación de 265 nm [Fig. 2a], 280 nm [fig. 2b] y 308 nm [Fig. 2c], donde los círculos rojos y las curvas representan una D de 10 mJ/cm2, y los círculos azules y las curvas representan una D de 5 mJ/cm2, respectivamente. Los valores de τs para ajustar las curvas para cada longitud de onda de irradiación se indican en la Tabla 2. Las curvas teóricas explican bien el comportamiento de inactivación como una función de τ bajo diferentes longitudes de onda de irradiación y condiciones D. Aunque la suposición de que ROS está involucrada en el daño del ADN27,28 es un tema que se abordará en el futuro, consideramos que el modelo estocástico presentado aquí explica bien no solo los resultados actuales sino también la amplia gama de constantes de velocidad de inactivación reportadas previamente12, 13,14,15,16,17,18,19.

Es interesante mostrar la diferencia en la cantidad de ROS generada por la radiación UV cuando D es constante pero P es diferente. La Figura 4a muestra el comportamiento temporal teórico de R(t) obtenido a 0,01 mW/cm2 con 1000 s (curva roja) o 10 mW/cm2 con 1 s (curva azul que se muestra en el recuadro) a la longitud de onda de irradiación de 265 nm. El comportamiento temporal de ambos R(t) muestra características de curva similares. Un punto notable es la diferencia en el valor pico; aunque la P varía por un factor de 1000, el valor máximo obtenido varía por un factor de sólo 60, tal como 150 a 10 mW/cm2 y 2,5 a 0,01 mW/cm2. Esta diferencia se origina en el término no lineal Γ4R(t)R(t), lo que implica que el estado de ROS de alta densidad es inestable y se produce la destrucción mutua de ROS38. La diferencia en el valor máximo conduce a la diferencia en la cantidad total de ROS en la misma D. La figura 4b muestra la cantidad total de ROS en función de τ en la misma D (265 nm, 10 mJ/cm2). Debido a la larga vida útil de las ROS (Γ3) y al término no lineal (Γ4), una irradiación más débil con una mayor duración genera una mayor cantidad de ROS. Consideramos que esta diferencia en la cantidad de ROS en función de τ es el mecanismo físico y químico que explica la gran diferencia en la eficacia de la inactivación al mismo D.

(a) Comportamiento temporal de R(t) obtenido a 0,01 mW/cm2 con 1000 s (curva roja) o 10 mW/cm2 con 1 s (curva azul en el recuadro) a la longitud de onda de irradiación de 265 nm. (b) Cantidad total de ROS en función de la duración de la irradiación a la misma dosis (265 nm, 10 mJ/cm2).

No pudimos observar un cambio significativo en la eficacia frente a P en la longitud de onda de irradiación de 308 nm. Este resultado es similar a los resultados observados por Oguma et al.16 pero es contrario a los hallazgos de Pousty et al.27. La razón de esto no se entiende claramente; sin embargo, consideramos que esta diferencia en la eficacia se origina en la diferencia en la cepa: cuando usamos una cepa O1 simple, Oguma et al. utilizaron la cepa K12 IFO 330116 y Pousty et al. utilizó la cepa MG166527. Para aclarar este problema, ahora se están investigando otras cepas de la bacteria E. coli. El hecho de que no pudiéramos observar una reducción significativa en la eficacia a la longitud de onda de irradiación de 308 nm probablemente sugiere que el mecanismo de generación de ROS por luz UV se correlaciona con el espectro de absorción de ADN19,39,40 y/o proteína41,42, 43,44,45,46 especies.

La tendencia en el comportamiento de la P y la eficacia obtenida en este trabajo parece concordar con los estudios previos9,13,47,48,49. Para una P más pequeña, se informó una constante de velocidad de inactivación más alta. Por ejemplo, a una longitud de onda de irradiación de 265 nm, para la cepa E. coli K12 29425, la tasa de reducción notificada es Log (N/N0) = − 1,5 para 5 mJ/cm2 y − 2,5 para 10 mJ/cm2 en la P más pequeña región (0,030-0,060 mW/cm2)47; sin embargo, en la región P más grande (0,19–0,55 mW/cm2), la tasa de reducción disminuye como Log (N/N0) = − 1 para 5 mJ/cm2 y − 2 para 10 mJ/cm248. Se informó una tendencia muy similar para E. coli CGMCC 1,3373, y la tasa de reducción informada es Log (N/N0) = − 1,5 para 5 mJ/cm2 y − 4,5 para 10 mJ/cm2 en la región P más pequeña (0,05 mW/ cm2)13; sin embargo, en la región P más grande (0,384 mW/cm2), la tasa de reducción disminuye como Log (N/N0) = − 1 para 5 mJ/cm2 y − 3 para 10 mJ/cm249.

Señalamos aquí que los procesos de nacimiento y muerte de E. coli no se consideraron en este análisis, porque los ensayos de inactivación se realizaron en una fase estacionaria [E. coli en una solución salina normal (0,9% NaCl)]. Sin embargo, cuando realizamos los ensayos de inactivación UV en una fase bien nutrida (fase logarítmica), tenemos que considerar el tiempo de duplicación, porque E. coli en estado bien nutrido se divide cada 20 min50. En este caso, es necesario introducir en este modelo estocástico los procesos de nacimiento y muerte que muestran este efecto de proliferación.

En este documento, hemos aclarado la diferencia significativa en la eficacia de la inactivación de E. coli bajo la misma D pero diferentes Ps y τs a una longitud de onda fija. Aunque la producción de dímero de timina y la producción de ROS no se confirmaron experimentalmente, creemos que durante el proceso de inactivación UV, además de la formación de dímeros de timina en el ADN, otro factor, como las ROS, jugó un papel importante en la inactivación de bacterias. La eficacia de la inactivación por ROS depende de la P, mientras que la formación de dímeros de timina depende de la D. Para probar que las ROS desempeñan un papel en la inactivación, es necesario cuantificar y medir la cantidad de ROS por irradiación UV.

Se han informado varios valores de la constante de velocidad de inactivación para la inactivación UV de una bacteria y/o virus, incluso cuando se utiliza la misma fuente de luz y la misma longitud de onda de irradiación9,10,11. Una de las razones de esta discrepancia podría ser la diferencia en las cepas y sus entornos de las bacterias. Sin embargo, de acuerdo con los resultados experimentales y teóricos obtenidos aquí, es probable que las constantes de velocidad de inactivación de UV reportadas hasta ahora estén compuestas por valores mixtos de dos procesos de inactivación que dependen de la magnitud de P. Por lo tanto, las constantes de velocidad de inactivación reportadas en el la literatura varía ampliamente, incluso cuando se utilizaron la misma longitud de onda de irradiación y los mismos tipos y cepas de bacterias y virus. Para validar la aplicabilidad del modelo obtenido aquí a un conjunto más amplio de patógenos, los experimentos de inactivación que combinan irradiación a corto plazo con alto P son necesarios para determinar las constantes de tasa de inactivación UV reales.

La cantidad de radiación UV a la que puede estar sujeto el cuerpo humano está limitada por un valor límite de umbral (TLV) para cada longitud de onda según el folleto de la Conferencia Estadounidense de Higienistas Industriales Gubernamentales (ACGIH)-TLV51. Los resultados del presente estudio muestran que para la misma D, la inactivación a una P más baja y un τ más largo es más eficiente que la inactivación a una P más alta y un τ más corto. La eficacia de la irradiación UV prolongada a una P más baja puede reducir la D y el riesgo para el cuerpo humano. Por lo tanto, consideramos que esta información es útil para la futura esterilización de grandes espacios como las habitaciones de los hospitales con luz ultravioleta. Para lograr tales tecnologías de iluminación con efectos germicidas, es necesario investigar el efecto de P en las mismas condiciones de D en varios tipos de bacterias y virus patógenos.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados en el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Descargar referencias

Los autores quisieran agradecer a Yuji Kohmura, Haruka Hattori y Ton Mu por su ayuda con los experimentos de inactivación UV. Los autores también quisieran agradecer al Dr. Masanori Isaka y al Dr. Hideyuki Matsui por la información acerca de las técnicas de manejo bacteriano. Este trabajo fue apoyado por una subvención de ayuda para la investigación en la Universidad de la ciudad de Nagoya (Número de subvención 2121102).

Escuela de Graduados en Ciencias Médicas, Universidad de la Ciudad de Nagoya, Nagoya, 467-8601, Japón

Takahiro Matsumoto, Ichiro Tatsuno y Tadao Hasegawa

Escuela de Graduados en Diseño y Arquitectura, Universidad de la Ciudad de Nagoya, Nagoya, 464-0083, Japón

Takahiro Matsumoto y Yukiya Yoshida

Departamento de Física, Facultad de Ciencias, Universidad de Shizuoka, Shizuoka, 422-8529, Japón

makoto tomita

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TM es el primer autor. IT, YY, MT y TH contribuyeron al diseño del sistema de inactivación UV-LED; YY, IT y TM realizaron los experimentos de inactivación de E. coli UV-LED; y TH proporcionó apoyo técnico y experiencia bacteriana para las técnicas de crecimiento bacteriano. TMMT y YY construyeron y analizaron el modelo cuantitativo que describe la diferencia en la eficacia de inactivación frente a la irradiación a la misma dosis. Todos los autores leyeron y aprobaron este manuscrito enviado.

Correspondencia a Takahiro Matsumoto.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Matsumoto, T., Tatsuno, I., Yoshida, Y. et al. Mecanismo de reciprocidad dosis-tiempo para la inactivación de Escherichia coli explicado por un proceso estocástico con dos efectos de inactivación. Informe científico 12, 22588 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26783-x

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Recibido: 05 junio 2022

Aceptado: 20 de diciembre de 2022

Publicado: 30 diciembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26783-x

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